皓奇星 | 高表达细胞株是怎样练成的?
2019-12-01

原创作者:耗子哥

波动细胞株作为生物制药CMC的底子事情,一直被器重和注目,正所谓“成也萧何,败也萧何”,一个好的细胞株每每能使得后续的工艺开辟事情事半功倍,大幅低落抗体/重组卵白的消费本钱;反之则必要破费更多的工夫去举行下游工艺的优化和改进,既延伸了项目工夫,又破费了更多的资金。明天的皓奇星栏目凯发便来介绍一下细胞株构建的流程。

CHO细胞汗青久长,并拥有巨大的家属。从1919年,北京协和医学院的Dr. E.T. Hsieh 在北京郊野抓了一些中国仓鼠用作植物模子开端,不停到1948年12月,由美国大夫Robert Briggs Watson在协和医学院的Cheng siang-Hu传授的帮忙下将20只中国仓鼠赶在南京束缚前送到上海,并从上海运送到纽约,最初由Victor Schwentker公司驯养成一种实行室植物品系,中国仓鼠不停作为一种实行室研讨用植物模子(想到这里笔者切齿痛恨[qiē chǐ tòng hèn],要不是当时中国处于战乱,本人没有才能保管,也不至于明天被ATCC和ECACC掐住脖子)。后Puck乐成分散到了中国仓鼠卵巢细胞并体外培育,在接上去的几十年里CHO细胞家属不停强大,被普遍使用于生物制药范畴。

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图1. CHO细胞品系的汗青

Florian M. Wurm and Maria João Wurm.Cloning of CHO Cells, Productivity and Genetic Stability-A Discussion.

明天差别品系的CHO细胞被用于重组卵白的表达,此中有代表性的包罗:

表1. 常用贸易化宿主细胞株

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差别的宿主细胞在细胞株构建中的体现差别很大,本文仅能从笔者有限的履历中提供一些参考,关于开端触及细胞株事情的冤家,可以推销商品化的宿主细胞试剂盒,并依照阐明书举行操纵,熟习细胞的特征后,再自行优化挑选方法。种种宿主细胞均有各自优劣,利用者必要思索包罗表达程度、卵白质量、贸易受权等各方面要素,比方上风方面,GS体系下表达量和Qp绝对较高,DG44体系细胞株波动性好,K1 挑选周期短且表达量高,CHO-S贸易受权明晰;反过去缺陷方面GS体系代价昂贵,DG44表达量较低,K1细胞株波动性较差,CHO-S绝对易结团等等。真正有履历的研讨职员,则可以依据差别细胞的特征,开辟符合的挑选方法和培育工艺,将细胞的潜能发掘到最大,正如鄙谚所说“Less is more”,细胞株构建亦然

消费用波动细胞株的构建起首由表达载体的构建和细胞转染开端

1、将表达抗体的目标基因构建到载体上,再将该载体转染进入宿主细胞内,罕见的转染方法次要有钙转、电转、脂质体转染和逆转录病毒转染,DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组当中去,因而表达程度与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。

2、接上去差别挑选试剂将被用于挑选可以准确表达目标基因而且高程度表达的细胞群(pool)。

3、由于此时失掉的细胞群中的每个细胞特征各别,具有差别的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率,因而必要将此中具有高产、波动表达特征的细胞个别分散出来辨别培育,通常必要取得数百乃至上千的候选克隆供进一步挑选。

4、被挑选出来的克隆颠末传代培育和分批补料实行(Fed-batch),比力其生长特征、代谢情况、表达量上下、表达产品质量等,选出最优的几个克隆进入生物反响器缩小实行,同步评价细胞株波动性,终极确定消费用单克隆细胞株。


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图2. 细胞株构建流程图 (以GS体系为例)

Soo Min Noh, Seunghyeon Shin and Gyun MinLee. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selectionfor the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies.

挑选标志

为了无效地挑选出高表达的细胞,表达载体上除了包括抗体的重、轻链以外,每每还含有种种挑选标志,挑选标志一样平常可以被分为两大类:一类因此G418为代表的抗生素类挑选标志,另一类因此MTX为代表的影响细胞代谢的挑选标志。与此同时,高效的启动子(如CMV)和延伸因子(如EF1α)被普遍运用于抗体表达载体。翻译的肇始地位是恒定的Kozak序列:GCC GCC(A/C)CC和抗体特异性的信号肽——差别的重轻链范例有各自特异的信号肽序列。

表2.常用挑选标志

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地位效应

拔出染色体的地位影响真核基因的表达,即“地位效应”。当外源基因拔出异染色质及其左近地区发生地位效合时,此处异染色质地区将发生地位效应雀斑,此时,四周的异染色质将无效地制止拔出基因的表达。为了克制“地位效应”,一样平常有两种措施:1、将目标基因定点整合到符合的位点;2、在目标基因的侧翼加上“绝缘子”DNA序列,从而克制“地位效应”。

细胞群

当目标基因被转染到宿主细胞内,并依照肯定的细胞密度在符合的挑选压力下举行传代培育后便失掉了细胞群(pool)。细胞群的表达量取决于转染的方法、挑选压力的作用以及目标基因整合状况 。由于差别的宿主细胞在挑选条件下的特征差别,针对差别的宿主细胞,可以接纳差别的细胞群挑选方法,包罗是摇瓶中大范围的细胞群的挑选照旧孔版中的迷你细胞群的挑选,亦或是选择符合的挑选压力巨细,目的是在较短的工夫内可以挑选失掉表达量绝对较高的细胞群。关于差别的项目,在细胞群阶段必要观察的尺度差别,关于惯例新药抗体,每每表达量会成为第一评价尺度;关于生物相似物,则需在细胞群阶段偏重观察各项质量参数与原研的差别;关于双特异性抗体,则必要在此阶段就开端观察准确拆卸的比例,从而低落克隆挑选阶段的危害。

常用的挑选克隆的办法

❖ 有限浓缩法(Limiting dilution cloning,LDC)由于其低本钱和易于操纵,被普遍运用于克隆的挑选。必要留意的是,为切合FDA的报告要求需举行两轮LDC,且细胞密度<0.5细胞每孔大概一轮LDC联合图像证明,以验证单克隆性。有限浓缩法事情量大,每每必要运用主动化事情站举行高通量的挑选。

❖ 半固体培育基法举行单克隆的挑选。细胞生长在半固体培育中,构成单克隆细胞团,同时将抗体排泄在细胞团四周,半固体培育基中含有荧光标志的二抗,能与抗体Fc片断特异性联合,当用肯定波长的光举行引发时就能收回荧光。利用图像剖析软件可以对单克隆细胞团的巨细、荧光强度举行测定,从而挑选出生长茂盛、表达量高的单克隆细胞团。主动化的机器臂可以依照实行职员设定的参数将切合要求的细胞团挑取出来用于后续的扩展培育。半固体培育基法可以经过主动化的方法挑取单克隆细胞,大大加重了实行职员的事情包袱,但用于荧光扫描、图像剖析和克隆挑取的呆板代价昂贵,且为切合报告要求,必要两轮半固体培育基挑选或一轮半固体培育基挑选联合一轮LDC举行。

❖ 流式细胞仪分选法(FACS)。将带有荧光标志的二抗和排泄抗体的CHO细胞混淆孵育,排泄到细胞外表的抗体就可以被流式细胞仪检测到,从而使用其分选功效挑选出排泄多的细胞。为了使排泄到胞外的抗体可以维持在细胞膜外表,还可以利用微囊将细胞以及排泄的抗体包裹起来。

克隆挑选事情往是微量、高通量,检测和操纵手腕的改进和晋级十分紧张,如HTRF(均相工夫辨别荧光),可以利用较小的样品量(2.5-5.0μL)举行高通量(384孔板)检测,联合主动化事情站的帮助,可以大幅低落研发职员的事情量。

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图3.单克隆成像体系下单克隆细胞扩增的历程(利用MD CloneSelect Imager 拍摄) 

良好的单克隆细胞株还要思索到细胞生长、表达和代谢状况,以及目标卵白的质量程度。要存眷乳酸和氧的代谢,高乳酸和高耗氧大概为细胞株在反响器的培育埋下隐患。细胞株的工艺要思索到将来反响器中培育的可反复和可缩小性,同时选择可及性较强,批次波动的培育基和补料。培育基的代价跟用量高度相干,依据笔者的履历,年利用量从100L进步到10000L,培育基的单价可以相差5-10倍,大范围利用时,入口贸易化培育基的代价一样平常会处于100-200元/升,而倘使拥有本人的CD培育基配方,委托GE、Merck大概Thermo等消费,其代价则会进一步降落到30-100元/升。因而初期大可不必为培育基的单价太甚担忧,同时在选择好符合的供给商后可以尽早与供给商睁开量价会商,明白大范围利用后的代价。