皓奇星 | 细胞培育工艺优化之培育基篇
2019-12-01

原创作者:小欣


择要:

继皓奇星高表达株细胞是怎样炼成的大众号公布之后,信赖不少读者对怎样构建细胞株有了肯定的理解,一个良好的细胞株能让培育工艺开辟事情到达事半功倍的结果,为只管即便减短项目标晚期研发工夫,通常可以利用平台化的工艺举行缩小消费。那么作为凯发工艺人来说,除了缩小研讨及消费外,怎样经过工艺开辟,让高表达细胞株的表达程度和产品格量能扶摇直上[fú yáo zhí shàng]更进一步,是一项不小的应战。

工艺开辟事情千绪万端,每一个培育的细节都是开辟必要思索的要素,如培育基、补料、培育温度、搅拌转速、溶氧参数、pH参数等等,别的差别的培育方法,除传统的补料流加培育,比年来衰亡的高密度接种、灌流培育等等,也是工艺开辟的热门。纵观这些要素,培育基及补料的开辟和优化,在整个工艺开辟历程中至关紧张,无论是传统的批次补料培育,照旧灌流培育,培育基和补料对产品的产量和质量均有无足轻重[wú zú qīng zhòng]的影响,实践上灌流培育工艺开辟的后期底子是培育基的开辟,不然从本钱角度思索简直表现不出灌流的上风。本期皓奇星栏目将接力细胞株构建,从细胞生命纪律的角度,一同学习培育基是怎样发扬作用的。

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图1.CHO-GS克隆在差别培育基中培育的终极表达量

(克隆及培育基泉源:凯发生物)

1 培育基身分概述

细胞吸取养分物质,分解本身构成物质,最初举行增殖必要肯定的物质底子,如水、无机盐等无机物和卵白质、核酸、脂质、糖类等无机物,这些物质底子组成了细胞的布局底子,如细胞膜,细胞质,细胞器,细胞核等等。只需培育的是具有生长和增殖才能的细胞,就必需提供根本浓度的这些物质底子,而凯发构建的CHO细胞作为消费工场,显然必要添加更多的养分身分去支持目标产品的分解。培育基的身分十分庞大,次要包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物、油脂、激素、生长因子等等。各种身分的作用及添加状况见下表。

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2  能量代谢及动力物质

细胞的统统生命运动都离不开能量,其生长增殖和卵白表达必要斲丧少量的能量,有研讨标明每个细胞的均匀干严重概在400pg,此中50%以上身分为卵白质,而卵白质分解次要是氨基酸经过肽键毗连而成,每一个肽键的分解必要斲丧3个ATP能量,而氧化一分子葡萄糖终极才发生约30个ATP能量,可见细胞就分解本身卵白必要斲丧几多能量,而一个高表达细胞株Qp能到达50pg以上,即每个细胞天天表达50pg卵白,占到本身总卵白近1/4。

葡萄糖作为培育基中最次要的动力物质被细胞吸取使用。它起首经过质膜上的转运卵白进入细胞,在胞质内经多个步调被剖析为丙酮酸,这个历程称为糖酵解,此中一局部丙酮酸进入线粒体被完全氧化为水和二氧化碳并发生能量的历程即为TCA循环,TCA循环是细胞发生能量的次要方法,在细胞疾速生长阶段,大局部丙酮酸(约90%)是在乳酸脱氢酶的作用下天生乳酸并排泄到胞外,以是这个阶段会呈现乳酸的积聚,低落了葡萄糖的使用服从。除此之外,葡萄糖经过磷酸戊糖途径可发生磷酸核糖,磷酸核糖是分解核苷酸的紧张质料。

谷氨酰胺是仅次于葡萄糖的第二大动力物质,谷氨酰胺除了用于分解细胞本身物质及目标卵白外,大局部的谷氨酰胺被转化成谷氨酸,谷氨酸进一步变化成α酮戊二酸落伍入TCA循环发生能量。必要留意的是GS体系的CHO细胞,由于转入了外源性的谷氨酰胺分解酶基因,以是不必要从外界获取谷氨酰胺,其表达的谷氨酰胺分解酶可将谷氨酸分解谷氨酰胺。

3  氨基酸代谢及氨基酸类添加身分

氨基酸是细胞分解卵白的分子底子,包罗布局功效卵白和目标卵白。氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸,非必需氨基酸可由哺乳植物细胞分解,必需氨基酸细胞不克不及本身分解,必需由外情况提供,在培育基开辟历程中,由于目标产品表达程度较高,细胞本身分解非必需氨基酸的速率一旦跟不上目标卵白的分解速率,则容易产生错配影响产品的表达,以是一样平常会添加一切约20种氨基酸。氨基酸浓度的优化是培育基开辟中最紧张的关键,其浓度的巨大改动就能明显影响细胞的生长和卵白的表达。固然,在重组细胞中,大局部氨基酸用于分解卵白质,另有一局部氨基酸被用于分解别的物质,如核酸和脂类物质。

氨基酸的代谢由于有配合的布局特点,因而有许多配合之处,但差别的氨基酸由于布局上的差别,代谢有差别之处,次要代谢去处如下表统计。


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从上表能看出,由于大局部的氨基酸经过脱氨基作用发生响应的α酮酸和氨根离子,因而氨根的积聚是细胞培育中不行疏忽的要素。别的,某些氨基酸经过转氨基作用可以天生别的氨基酸,这些氨基酸既属于非必需氨基酸。必要留意的是,由于酪氨酸和半胱氨酸的难溶性题目,一样平常以碱溶液的方法举行补料添加,如今市场上已有一些易于消融的替换品,如默克开辟的磷酸酪氨酸二钠盐和L半胱氨酸硫酸钠盐。


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图2.能量及氨基酸代谢通路

(图片泉源:Sara Pereira, Helene Faustrup Kildegaard, and Mikael Rørdam Andersen Impact of CHO Metabolism> Production: An Overview of Toxic and Inhibiting Metabolites and Nutrients)

4  维生素及其功效

细胞的统统生命运动离不开生物催化剂酶,维生素作为酶的联合剂,与酶联合后催化细胞的心理运动,如代谢,能量转移等等,培育细胞自己无法分解维生素,因而培育基中维生素是必需添加的一类物质,尤其是B族维生素,如硫胺素、核黄素、泛酸、吡哆醇、生物素、叶酸、氰钴胺素、肌醇和维生素C等。细胞培育历程中常用的维生素功效如下表所示。

有些培育基中会过量添加脂溶性维生素如生养酚,视黄醇大概添加维生素D的前体物质如胆固醇,只管这些脂溶性维生素对细胞的生长有肯定的影响,思索其添加的庞大性及难溶性,一样平常不思索优化这些身分。

5  无机盐及其对细胞的影响

细胞质基质作为细胞质溶胶添补于无形布局之间,化学构成次要包罗水、无机盐,脂类、糖类、氨基酸、核苷酸、卵白质等,为种种细胞器维持其正常布局和功效提供符合的离子情况及物质底物。以是符合的无机盐浓度是细胞维持浸透压及电位情况必需的。培育基中罕见的无机盐包罗钠、钾、镁、钙、氯离子、磷酸盐、硫酸盐、碳酸氢根等。此中钙离子在胞内信号转导中发扬偏重要的作用。磷酸盐除了作为缓冲盐之外,也是是核苷酸、核酸与磷脂的构成身分之一。镁离子作为ATP的共轭离子,其在培育基中的添加浓度较高,通常是mM级别添加。必要留意的是有文献报道符合的钠钾浓度比是细胞维持正常心理运动的底子。

6  微量元素及其次要作用

微量元素也作为辅酶因子到场调治细胞的心理运动,在培育基开辟的晚期阶段,由于培育基配制利用水的纯度较低,其包括了肯定水平的微量元素,如今由于配制水的纯度大幅度提拔,使得微量元素的开辟显得越发紧张,培育基中常用的微量元素包罗锌、铜、铁、锰、硒、钼等。

铁是铁硫卵白、过氧化物酶及过氧化氢酶的紧张构成局部,在气体运输、生物氧化和酶促反响中发扬紧张的作用。一样平常铁离子以络合物的情势被细胞使用,游离的或有效的螯和铁对细胞大概发生毒性,别的培育基中的超氧自在基或维生素C等复原剂可将三价铁复原为二价铁。思索转铁卵白的泉源及本钱题目,如今广泛用柠檬酸铁氨作为铁源参加到培育基中。

锌是含锌金属酶的构成身分,它与卵白的折叠相干,能与卵白质的二硫键无效联合,影响卵白的波动性和活性,在RNA/DNA分解、mRNA波动及细胞抗凋亡历程中起到了不行或缺的作用,锌离子同时还到场了谷胱甘肽和抗氧化酶如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活化,可掩护细胞免受ROS的打击。有文献报道锌离子浓度添加至25mg/L可以进步CHO卵白的表达。必要留意的是,当在培育基遭到氧化应激后,锌离子大概与培育基中的氧化物、过氧化物和硫化物构成沉淀物而流失,培育基中别的身分如EDTA也大概会由于螯和作用低落锌的使用率。

铜离子在培育基中以一价复原铜和二价氧化铜的均衡存在,它可以氧化培育基中别的身分如半胱氨酸和维生素C,可与胱氨酸构成螯合物沉淀而招致致细胞培育基中半胱氨酸和胱氨酸的丧失。培育基中半胱氨酸缺失后可中止卵白和谷胱甘肽的分解。别的,某些细胞系中,培育历程中从乳酸天生向乳酸斲丧的切换必要肯定浓度的铜离子存在。

7  脂质和脂质代谢

脂质是细胞膜的次要构成之一,细胞膜包管了细胞内情况的绝对波动,同时调治和选择响应物质收支细胞,是物质自在收支细胞的屏蔽,在物质运输和卵白排泄历程中也起了很紧张的作用。细胞膜构成非常庞大,次要含甘油磷脂、鞘磷脂、糖脂、胆固醇、卵白质和碳水化合物等,此中甘油磷脂中以磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸含量最高,其分解的根本质料为甘油、脂肪酸、磷酸盐、胆碱、丝氨酸和肌醇等,而鞘磷脂的次要分解质料包罗脂酰CoA和丝氨酸,别的还必要吡哆醛等辅酶的到场。以是培育基中必要添加胆碱、乙醇胺、肌醇等等这些质料身分。

脂肪酸和甘油次要由葡萄糖代谢转化而来,哺乳植物细胞由于不克不及分解9碳以上的不饱和键,在培育基中可以添加过量浓度的亚油酸和亚麻酸,大概花生四烯酸等,但思索到这些物质的泉源题目,及添加的庞大性,需审慎开辟。胆固醇作为细胞膜的根本布局身分之一,是决议细胞膜性子的一种紧张身分,同时可以转化为脂溶性维生素D3的前体。

8  抗氧化物质

一切细胞在培育历程中均会产生氧化应激,发生氧化两头产品,在无血清培育基系统中因缺乏抗氧化物质而更分明,随着活性氧浓度的增长会发生超氧自在基和过氧化氢,这些分子会毁伤脂类、卵白和DNA使细胞遭到损伤。细胞存在两类抗氧化体系,一类是酶抗氧化体系,包罗超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶,另一类黑白酶抗氧化系统,维生素C、维生素E、谷胱甘肽、硫酸楚、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒等。在培育基设计的时分一方面必要利用抗氧化物质使细胞能有反抗氧化情况的才能,另一方面是增加培育基中不波动身分被氧化的概率。

谷胱甘肽作为培育基中常添加的抗氧化物质,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成。在重组卵白表达历程中,目标卵白表达越多,细胞必要应对的氧化应激越明显,发生越多的氧化型谷胱甘肽,有文献报道氧化型谷胱甘肽的累积是细胞殒命的晚期凋亡信号,是除了氨根和乳酸之外惹起细胞凋亡的另一要素。


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图3.谷胱甘肽的分解及代谢

(图片泉源:Sara Pereira, Helene Faustrup Kildegaard, and Mikael Rørdam Andersen Impact of CHO Metabolism> Production: An Overview of Toxic and Inhibiting Metabolites and Nutrients)

9   核苷类物质

细胞分解嘌呤和嘧啶核苷酸必要氨基酸作为质料,如嘌呤的分解必要甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳单元,嘧啶的分解必要天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳单元,这是细胞分解核苷酸的此中一条途径,即重新分解途径,另一条是弥补途径,即以现成的核苷和碱基为底子分解核苷酸。DHFR能将二氢叶酸复原为四氢叶酸,而四氢叶酸是核苷酸重新分解途径的一个要害底物,DHFR缺陷型细胞因而无法重新分解核苷酸,需在培育基中添加现成的核苷类物质如次黄嘌呤和胸苷才干存活。CHO-DHFR细胞的设计便是基于这个原理,经过外源性拔出DHFR和目标基因,即可在无次黄嘌呤和胸苷的培育基中生长,同时添加DHFR克制剂可增长DHFR和目标基因的拷贝数。一样平常核苷类物质占细胞干重的比例很低,不凌驾5%,且细胞本身能分解,以是培育基中的添加量很低或不添加。

10  生长因子

生长因子可促进细胞的生长和增殖,如胰岛素,能调治细胞的代谢历程,促进细胞对葡萄糖的吸取和使用,同时能促进脂肪酸和卵白质的分解,一样平常培育基中会添加,但思索培育基本钱,如今广泛寻求能替换的化合物。

11  别的身分

细胞培育理化情况除了提供符合的浸透压之外,还必要符合的粘度,培育基中常用的F68,是一类聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物,属非离子外表活性剂,具有洗濯和消泡功效,其聚氧乙烯的比例越大,则亲水性越强,细胞缓冲结果越好,洗濯活性也越强,而聚氧丙烯的比例越大则消泡才能越强,固然毒性也越大。培育基中添加1-2g/L浓度的泊洛沙姆在细胞抗剪切力方面有较好的结果,但缺陷是容易构成泡沫。缓冲剂为培育基提供了波动的pH范畴,罕见的缓冲剂包罗碳酸盐,磷酸盐缓冲系统以及HEPES。硫酸葡聚糖作为抗结团剂也是培育基中罕见的一种添加剂。

A high-throu细胞代谢扑朔迷离[pū shuò mí lí],触及到的身分千万万万,怎样利用有限的身分开辟出良好的培育基,是工艺人不停面对的困难之一。必要凯发起首从迷信的角度动身,理解细胞的根本生命纪律,熟习根本生命物质的前因后果[qián yīn hòu guǒ],再是自创后期的研讨效果,培育基开展的宿世此生履历了几多代迷信家的不懈高兴,在此底子上字斟句酌[zì zhēn jù zhuó],才干走的更远,最初必要借助古代化的剖析检测技能,剖析物质的斲丧和产出,从化学计量角度去完成细胞产能的最大化和最优化。


参考文献:

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